Tecnologia
Introdução
Os ensaios imunológicos são baseados na capacidade que as proteínas de imunoglobulina (anticorpos) têm de distinguir estruturas tridimensionais no nível molecular. Os anticorpos são produzidos pelo sistema imune dos animais superiores em resposta a materiais estranhos e para a eliminação dos mesmos. Esta capacidade de discriminar e estabelecer ligações fortes com estruturas exclusivas em misturas complexas proporciona os meios para medir essas estruturas em condições de reação controlada.
A técnica de ensaio radioimunológico (RIA) utilizando isótopos radioativos como rótulos foi explorada, pela primeira vez, por Yalow e Berson, para avaliar a quantidade de insulina, o que lhes valeu um prêmio Nobel em 1977. Uma tecnologia de ensaio imunológico de segunda geração substituiu os isótopos radioativos por enzimas usadas com substratos cromogênicos (EIA) eliminando os problemas de manuseio e descarte. Mais recentemente, o uso de membranas poliméricas e partículas coloridas resultaram no desenvolvimento de ensaios de seleção no campo com um mínimo de manipulação.
A técnica de ensaio imunológico é amplamente usada em laboratórios clínicos como base para decisões a respeito de diagnósticos e terapia. O mercado atual, em nível global, para ensaios imunológicos clínicos supera a casa dos 60 bilhões de dólares. Desde os últimos anos da década de 1980, a tecnologia de ensaios imunológicos vem sendo aplicada às análises de interesse ambiental e de segurança alimentar. Embora essas aplicações atualmente representem uma pequena parcela do mercado de exames clínicos, elas estão se tornando, rapidamente, cada vez mais aceitas e utilizadas devido às evidentes vantagens em termos de custo, rapidez, e às possibilidades de realizar exames de forma descentralizada.
Princípios
Os ensaios imunológicos podem ser divididos em duas principais categorias: ensaios competitivos e ensaios não competitivos ou tipo sanduíche. Os ensaios competitivos utilizam um único tipo específico de anticorpo imobilizado em uma superfície sólida e um análogo correspondente à substância a analisar para portar o rótulo. No ensaio, a substância a analisar na amostra compete com o análogo “rotulado” para fazer a ligação com o anticorpo. Após a separação do análogo não ligado, a quantidade de rótulo remanescente é medida e é inversamente proporcional à concentração da substância a analisar na amostra.
Os ensaios não competitivos utilizam dois anticorpos específicos para envolver a substância a analisar. Um anticorpo (anticorpo de captura) é imobilizado em uma superfície sólida e o segundo anticorpo porta o rótulo. No ensaio, a substância a analisar tem, simultaneamente, uma ligação com os anticorpos de captura e rótulo. Após a separação do anticorpo de rótulo não ligado, o rótulo remanescente é medido e é diretamente proporcional à concentração da substância a analisar na amostra. Os ensaios tipo sanduíche são limitados às substâncias a analisar de tamanho suficiente para estabelecer a ligação com dois anticorpos simultaneamente, geralmente proteínas e microorganismos. Os ensaios competitivos são compatíveis com uma grande variedade de substâncias a analisar na área ambiental e de segurança alimentar. No entanto, mesmo no caso dos ensaios competitivos, há um limite inferior de peso molecular (ou exclusividade estrutural) ao qual a técnica pode ser aplicada.
O princípio subjacente a todos os ensaios imunológicos é que as condições de reação do ensaio não variam com exceção da concentração da substância a analisar no calibrador ou amostra.
Considerações Para Utilização
A aplicabilidade dos ensaios imunológicos aos requisitos analíticos é determinada por vários fatores incluindo o tipo de amostra, o rendimento da amostra, qualitativo ou quantitativo e especificidade. Os ensaios imunológicos provavelmente se prestam mais aos programas de seleção de grande escala ou de rotina, nos quais a natureza das substâncias a analisar é conhecida. A especificidade dos anticorpos, ou a sua capacidade de estabelecer a distinção entre estruturas químicas com uma relação muito próxima, varia enormemente. Por exemplo, o anticorpo usado no conjunto Beacon s-Metolacloro pode estabelecer a distinção entre os isômeros “r e “s” do metolacloro da mesma forma que entre o metolacloro e outras cloroacetanilidas. Por outro lado, o anticorpo usado no conjunto Beacon 2,4-D não conseguir distinguir ácido 2,4-D de ésteres 2,4-D ou outros compostos clorofenoxi similares. No caso do 2,4-D a resposta do ensaio imunológico será o somatório de todas as concentrações das espécies reativas sem a capacidade de quantificar as espécies individualmente. Por outro lado, um resultado negativo com um ensaio com grande especificidade pode proporcionar informações sobre a ausência de uma série de compostos. Portanto, os ensaios imunológicos, em geral, não são adequados para situações de pesquisa nas quais o contaminante específico precisa ser identificado a partir de uma ampla gama de possibilidades.
Os ensaios imunológicos utilizam reagentes de origem biológica, e, portanto, funcionam muito bem em condições que se aproximam das fisiológicas. A amostra ideal é água ou um extrato de amostra aquosa. A sensibilidade dos ensaios imunológicos aos solventes orgânicos também pode variar muito. Por exemplo, o conjunto de Aflatoxina da Beacon atinge sensibilidade de ppb em 35% de metanol. A consideração importante é que as condições de reação para as amostras são as mais similares possíveis como condições para calibradores.
Os ensaios imunológicos podem proporcionar sensibilidade sub-ppb em menos de 15 minutos, a baixo custo por amostra, em locais remotos, bem como em laboratórios nos grandes centros. Alguns exemplos típicos de sua utilização podem ser os testes de amostras de recebimento de grãos quanto à contaminação por micotoxina ou o teste de água não tratada e água potável quanto ao conteúdo de atrazina.
A equipe da Beacon assume o compromisso de trabalhar em estreita cooperação com os seus clientes para assegurar que a tecnologia de ensaios imunológicos seja utilizada da maneira mais acurada e eficiente de modo a atender aos seus requisitos de ensaios. Favor entrar em contato conosco e responderemos às suas consultas prontamente.
Introduction
Immunoassays are based on the ability of immunoglobulin proteins (antibodies) to distinguish three-dimensional structure at the molecular level. Antibodies are produced by the immune system of higher animals in response to and for the elimination of foreign materials. This ability to discriminate and bind strongly to unique structures in complex mixtures provides the means to measure those structures in controlled reaction conditions.
The radio-immunoassay (RIA) technique utilizing radioactive isotopes as label was first exploited by Yalow and Berson to quantitate insulin for which a Nobel prize was awarded in 1977. A second generation immunoassay technology replaced radio-isotopes with enzymes used with chromogenic substrates (EIA) eliminating handling and disposal issues. More recently, the use of polymeric membranes and colored particles have led to the development of field screening assays with minimal manipulations.
The immunoassay technique is widely used in clinical laboratories as the basis for decisions on diagnosis and therapy. The current world-wide market for clinical immunoassays is greater than 60 billion dollars. Since the late 1980’s immunoassay technology has been applied to analytes of environmental and food safety concern. While these applications currently represent a small fraction of the clinical testing market, they are rapidly becoming more widely accepted and utilized due to the obvious advantages in cost, speed and decentralized testing possibilities.
Principles
Immunoassays can be divided into two major categories: competitive and non-competitive or sandwich assays. Competitive assays utilize a single specific antibody type immobilized to a solid surface and a corresponding analogue of the analyte to carry the label. In the assay, analyte in the sample competes with the labeled analogue for binding to the antibody. After separation of unbound analogue, the amount of label remaining is measured and is inversely proportional to the analyte concentration in the sample.
Non-competitive assays utilize two specific antibodies to sandwich the analyte. One antibody (capture antibody) is immobilized to a solid surface and the second antibody carries the label. In the assay, analyte is bound simultaneously by both the capture and label antibodies. After separation of unbound label antibody, the remaining label is measured and is directly proportional to analyte concentration in the sample. Sandwich assays are limited to those analytes of sufficient size to be able to bind two antibodies simultaneously, typically proteins and microorganisms. Competitive assays are compatible with a wide range of analytes and are used for the majority of low molecular weight organic analytes of environmental and food safety concern. However, even with competitive assays there is a lower limit of molecular weight (or structural uniqueness) to which the technique can be applied.
The underlying principle in all immunoassays is that assay reaction conditions do not vary except for the concentration of analyte in the calibrator or sample.
Considerations for Use
The applicability of immunoassay testing to analytical needs is determined by a number of factors including sample type, sample throughput, qualitative or quantitative and specificity. Immunoassay testing is probably best suited to large scale or routine screening programs where the nature of the analytes being tested is understood. The specificity of antibodies, or their ability to distinguish between closely related chemical structures varies widely. For instance, the antibody used in the Beacon s-Metolachlor kit can distinguish between the “r” and “s” isomers of Metolachlor as well as between Metolachlor and other chloro-acetanilides. On the other hand, the antibody used in the Beacon 2,4-D kit can not distinguish 2,4-D acid from 2,4-D esters or other closely related chlorophenoxy compounds. It the case of 2,4-D the immunoassay response will be the sum total of the concentrations of the reactive species without the ability to quantify the species individually. On the other hand, a negative result with an assay with wide specificity can yield information on the absence of a range of compounds. Immunoassays are, therefore, not typically well suited for survey situations where the specific contaminant needs to be identified from a wide range of possibilities.
Immunoassays utilize biologically-derived reagents and therefore function optimally in conditions which approximate physiologic. The ideal sample is either water or an aqueous sample extract. The sensitivity of immunoassays to organic solvents can also vary widely. For instance, the Beacon Aflatoxin kit achieves ppb sensitivity in 35% methanol. The important consideration is that the reaction conditions for samples are as similar as possible as conditions for calibrators.
Immunoassays can yield sub-ppb sensitivity in less than 15 minutes at a cost of less than $10 per sample at remote locations as well as centralized laboratories. Some typical examples of their use might be testing in-coming grain samples for mycotoxin contamination or testing of raw and finished drinking water for atrazine content.
The staff at Beacon is committed to working closely with customers to ensure that immunoassay technology is utilized in the most accurate and efficient manner to meet their testing needs. Please contact us for prompt response to inquiries.